T7-systemet
T7-systemet är ett system för att selektivt uttrycka gener hos bakterier i labbmiljö. Systemet är vanligt vid tillverkning av rekombinant protein. T7-systemet uppfanns 1986 av forskarna William Studier och Barbara Moffatt vid Brookhaven National Laboratory, USA.[1]
T7-systemet använder sig av E. coli-bakterier, som får tillverka proteinet. I E. coli finns en promotorsekvens som kallas lac-promotorn, som ingår i en grupp av gener som kallas lac-operonet. Lac-promotorn kontrollerar transkription av de gener som ingår i lac-operonet. I T7-systemet har man bytt ut dessa sammankopplade gener mot en gen som kodar för RNA-polymeras från bakteriofag T7. Aktivering av lac-operonet kräver närvaro av laktos och avsaknad av glukos. Man kan på konstgjord väg inducera lac-promotorn med en laktosanalog, exempelvis IPTG. Tillsats av IPTG inaktiverar laktosrepressorn (lacI) så att de gener som står under lac-promotorns kontroll kan uttryckas.[2]
T7-polymeraset har hög aktivitet – det syntetiserar RNA vid en hastighet av ungefär 300 nukleotider/sekund och är mycket snabbare än dess bakterievärds RNA-polymeras.[3] Det har också hög specificitet – det transkriberar specifikt gener som finns i anslutning till en annan promotor, T7-promotorn. För att utnyttja T7-systemet transformerar man först in en plasmid i cellen, där genen man vill transkribera ligger nedströms om T7-promotorn. Vid tillsats av IPTG startar tillverkningen av T7-RNA-polymeras som i sin tur hittar T7-promotorn och tillverkar det önskade proteinet.[2]
Ofta behöver experiment utföras när bakterierna befinner sig en fas som kallas logaritmisk tillväxt. Nu för tiden har förbättringar i tillvägagångssättet gjort att man kan se till att bakterierna befinner sig i denna fas när T7-promotorn aktiveras. Detta åstadkoms genom att man ser till att övriga kolkällor, inklusive glukos, i denna fas tar slut medan laktos kvarstår.[2]
Referenser[redigera | redigera wikitext]
- ^ F.William Studier, Barbara A. Moffatt (1986). Use of bacteriophage T7 RNA polymerase to direct selective high-level expression of cloned genes. Journal of Molecular Biology. sid. 113-130.
- ^ [a b c] Altman Laboratory (13 maj 2002). ”Autoinduction of Expression in the T7 Expression System”. Emory University. Arkiverad från originalet den 10 november 2012. https://web.archive.org/web/20121110001621/http://www.microbiology.emory.edu/altman/f_protocols/f_tetramers/autoind_annot.html. Läst 11 september 2012.
- ^ Krebs J. E., Goldstein E. S., Kilpatrick S. T. (2009). Lewin's genes X (10:e upplagan). Mississauga, Kanada: Jones and Bartlett Publishers. sid. 531. ISBN 978-0-7637-7992-4