Primer

Från Wikipedia
Hoppa till navigering Hoppa till sök
För primer inom måleri och målningsteknik, se Grundfärg, för primer inom sprängteknik, se primer (sprängteknik).

Primer (inom molekylärbiologi) är en kort enkelsträngad nukleinsyrasekvens som fungerar som startpunkt för DNA-syntes. Primern är nödvändig för DNA-replikation eftersom enzymet DNA-polymeras, som katalyserar denna process, endast kan addera nukleotider till en redan existerande DNA-sträng. DNA-polymeras startar replikationen vid 3' änden av primern och använder den motsatta strängen som mall för att skapa en ny komplemetär sträng. I de flestra fall av naturlig DNA-replikation utgörs primern av en kort RNA-sträng.[1]

Många laborativa tekniker inom molekylärbiologi och bioteknik vilka involverar DNA-polymeras, såsom DNA-sekvensering och PCR, kräver DNA-primers. Dessa primrar är vanligtvis korta syntetiska oligonukleotider, med en längd på cirka 20 baser. Primrarna är designade för att binda till en önskad DNA-sekvens, vilken sedan kan kopieras med hjälp av polymeraset.[1]

Mekanism in vivo[redigera | redigera wikitext]

Primrar används in vivo för DNA-replikation av den så kallade lagging strand, den sträng som är orienterad i riktning 5'→3'. Denna strängs komplement måste därför bli sytetiserad i 3'→5' riktning, eftersom DNA är antiparallel. Eftersom DNA-polymeras endast är verkasam i riktning 5'→3', syntetiseras lagging strand i korta fragment, så kallade Okazaki fragments. Detta sker genom att enzymet primas skapar RNA-primerar, DNA-polymeraset kan använda för att förlänga strängen i riktning 5'→3'.[2]

RNA fragmenten avlägsnas sedan och deoxyribonukleotider adderas för att fylla mellanrummen mellan Okazaki framgenten.[3]

Avlägsnande av primer[redigera | redigera wikitext]

I prokaryota celler avlägsnas RNA-primrarna med hjälp av RNase H, ett enzym som bryter ner RNA, samt polymerase I. Polymeras I har förmåga att hydrolysera fosfordiesterbindningar i RNA och därmed avlägsta nukelotider från 5'-änden av primern. RNA-primern ersätts sedan av deoxyribonukelotider för att skapa fragment enbart bestående av DNA.[2]

I eukaryota celler förlänger DNA-polymeras δ Okazaki fragmenten i riktning 5'→3'. När polymeraset når RNA-primern från det föregående Okazaki fragmentet ersätter enzymet 5'-änden av primern med ett enkelsträngat överhäng, vilket sedan avlägsnas genom klyvning med hjälp av exonukleas. DNA-polymeras δ förlänger Okazaki fragmenten och DNA-ligas sammangogar fragmenten genom att skapa fosfordiesterbindningar.[3]

Användande av syntetiska primrar[redigera | redigera wikitext]

DNA-sekvensering används för att bestämma ordningen av nukleotider i en DNA-sekvens. Sanger chain termination method är en metod för sekvensiering, som använder primrar för att starta reaktionen.[4]

I PCR används primrar för att specificera vilken DNA-sekvens som skall amplifieras. Längden på primrarna är oftast 20-30 nukleotider, och designas för att binda till början respektive slutet av den sekvens som önskas amplifieras. DNA-polymeras syntetiserar sekvensen genom att förlänga primern. De nya DNA-fragmenten används sedan som mall för ytterligare amplifiering, vilket leder till en exponentiel ökning av den önskade DNA-sekvensen.[5]

Design av primrar för PCR[redigera | redigera wikitext]

För PCR krävs två olika primrar som binder till början respektive slutet av den DNA-sekvens som önskas amplifieras. Dessa två primrar behöver ha liknande smältpunkt eftersom båda primrarna ska binda till DNA-templatet samtidigt under PCR-reaktionen. [6]

För att undvika amplifiering av en felaktig sekvens, behöver primrarna designas så att dessa endast kan binda till DNA-templatet vid önskad position. Primrana ska inte heller ha förmågan att enkelt kunna binda till sig själva eller andra primrar i lösningen, då detta kan förhindra att primrarna binder till templatet eller att provet blir kontaminerat.[6]

Källor[redigera | redigera wikitext]

  1. ^ [a b] ”primer | Learn Science at Scitable”. www.nature.com. http://www.nature.com/scitable/definition/primer-305. Läst 22 juni 2015. 
  2. ^ [a b] Cooper, Geoffrey M. (på en). DNA Replication. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/. Läst 22 juni 2015. 
  3. ^ [a b] ”Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation”. urresearch.rochester.edu. https://urresearch.rochester.edu/institutionalPublicationPublicView.action?institutionalItemId=6071&versionNumber=1. Läst 22 juni 2015. 
  4. ^ ”DNA Sequencing”. www.ocf.berkeley.edu. https://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html. Läst 22 juni 2015. 
  5. ^ ”Polymerase Chain Reaction (PCR)”. www.ncbi.nlm.nih.gov. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/. Läst 22 juni 2015. 
  6. ^ [a b] C W Dieffenbash, T M Lowe, G S Dveksler (1993). ”General concepts for PCR primer design”. Genome Research 3: sid. 30-37. http://www.nature.com/scitable/content/general-concepts-of-primer-design-8942407. Läst 22 juni 2015.