Primer

Från Wikipedia
Hoppa till: navigering, sök
För primer inom måleri och målningsteknik, se Grundfärg.

Primer (inom molekylärbiologi) är en kort enkelsträngad nukleinsyrasekvens som fungerar som startpunkt för DNA-syntes. Primern är nödvändig för DNA-replikation eftersom enzymet DNA-polymeras, som katalyserar denna process, endast kan addera nukleotider till en redan existerande DNA-sträng. DNA-polymeras startar replikationen vid 3' änden av primern och använder den motsatta strängen som mall för att skapa en ny komplemetär sträng. I de flestra fall av naturlig DNA-replikation utgörs primern av en kort RNA-sträng.[1]

Många laborativa tekniker inom molekylärbiologi och bioteknik vilka involverar DNA-polymeras, såsom DNA-sekvensering och PCR, kräver DNA-primers. Dessa primrar är vanligtvis korta syntetiska oligonukleotider, med en längd på cirka 20 baser. Primrarna är designade för att binda till en önskad DNA-sekvens, vilken sedan kan kopieras med hjälp av polymeraset.[1]

Mekanism in vivo[redigera | redigera wikitext]

Primrar används in vivo för DNA-replikation av den så kallade lagging strand, den sträng som är orienterad i riktning 5'→3'. Denna strängs komplement måste därför bli sytetiserad i 3'→5' riktning, eftersom DNA är antiparallel. Eftersom DNA-polymeras endast är verkasam i riktning 5'→3', syntetiseras lagging strand i korta fragment, så kallade Okazaki fragments. Detta sker genom att enzymet primas skapar RNA-primerar, DNA-polymeraset kan använda för att förlänga strängen i riktning 5'→3'.[2]

RNA fragmenten avlägsnas sedan och deoxyribonukleotider adderas för att fylla mellanrummen mellan Okazaki framgenten.[3]

Avlägsnande av primer[redigera | redigera wikitext]

I prokaryota celler avlägsnas RNA-primrarna med hjälp av RNase H, ett enzym som bryter ner RNA, samt polymerase I. Polymeras I har förmåga att hydrolysera fosfordiesterbindningar i RNA och därmed avlägsta nukelotider från 5'-änden av primern. RNA-primern ersätts sedan av deoxyribonukelotider för att skapa fragment enbart bestående av DNA.[2]

I eukaryota celler förlänger DNA-polymeras δ Okazaki fragmenten i riktning 5'→3'. När polymeraset når RNA-primern från det föregående Okazaki fragmentet ersätter enzymet 5'-änden av primern med ett enkelsträngat överhäng, vilket sedan avlägsnas genom klyvning med hjälp av exonukleas. DNA-polymeras δ förlänger Okazaki fragmenten och DNA-ligas sammangogar fragmenten genom att skapa fosfordiesterbindningar.[3]

Använande av syntetiska primrar[redigera | redigera wikitext]

DNA-sekvensering används för att bestämma ordningen av nukleotider i en DNA-sekvens. Sanger chain termination method är en metod för sekvensiering, som använder primrar för att starta reaktionen.[4]

I PCR används primrar för att specificera vilken DNA-sekvens som skall amplifieras. Längden på primrarna är oftast 20-30 nukleotider, och designas för att binda till början respektive slutet av den sekvens som önskas amplifieras. DNA-polymeras syntetiserar sekvensen genom att förlänga primern. De nya DNA-fragmenten används sedan som mallytterligare amplifiering, vilket leder till en exponentiel ökning av den önskade DNA-sekvensen.[5]

Design av primrar för PCR[redigera | redigera wikitext]

För PCR krävs två olika primrar som binder till början respektive slutet av den DNA-sekvens som önskas amplifieras. Dessa två primrar behöver ha liknande smältpunkt eftersom båda primrarna ska binda till DNA-templatet samtidigt under PCR-reaktionen. [6]

För att undvika amplifiering av en felaktig sekvens, behöver primrarna designas så att dessa endast kan binda till DNA-templatet vid önskad position. Primrana ska inte heller ha förmågan att enkelt kunna binda till sig själva eller andra primrar i lösningen, då detta kan förhindra att primrarna binder till templatet eller att provet blir kontaminerat.[6]

Källor[redigera | redigera wikitext]

  1. ^ [a b] ”primer | Learn Science at Scitable”. www.nature.com. http://www.nature.com/scitable/definition/primer-305. Läst 2015-06-22. 
  2. ^ [a b] Cooper, Geoffrey M. (på en). DNA Replication. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/NBK9940/. Läst 2015-06-22. 
  3. ^ [a b] ”Distinguishing the pathways of primer removal during Eukaryotic Okazaki fragment maturation”. urresearch.rochester.edu. https://urresearch.rochester.edu/institutionalPublicationPublicView.action?institutionalItemId=6071&versionNumber=1. Läst 2015-06-22. 
  4. ^ ”DNA Sequencing”. www.ocf.berkeley.edu. https://www.ocf.berkeley.edu/~edy/genome/sequencing.html. Läst 2015-06-22. 
  5. ^ ”Polymerase Chain Reaction (PCR)”. www.ncbi.nlm.nih.gov. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/probe/docs/techpcr/. Läst 22 juni 2015. 
  6. ^ [a b] C W Dieffenbash, T M Lowe, G S Dveksler (1993). ”General concepts for PCR primer design”. Genome Research "3": sid. 30-37. http://www.nature.com/scitable/content/general-concepts-of-primer-design-8942407. Läst 22 juni 2015.