Cytometri
Cytometri är en metod som mäter cellernas antal och egenskaper. De parametrar som kan mätas med cytometriska metoder inkluderar cellstorlek, cellantal, cellmorfologi (form och struktur), cellcykelfas, DNA-innehåll och förekomsten eller frånvaron av specifika proteiner på cellytan eller i cytoplasman.[1] Cytometri används för att karakterisera och räkna blodkroppar i vanliga blodprov, till exempel i ett blodstatusprov. På liknande sätt används cytometri också i cellbiologisk forskning och i medicinsk diagnostik för att karakterisera celler i många olika tillämpningar som är associerade med sjukdomar, till exempel cancer och AIDS.[källa behövs]
Cytometriska apparater
[redigera | redigera wikitext]Bildcytometrar
[redigera | redigera wikitext]Bildcytometri är den äldsta formen av cytometri. Bildcytometrar fungerar genom att statiskt avbilda ett stort antal celler med hjälp av optisk mikroskopi. Före analysen färgas ofta cellerna för att öka kontrasterna eller för att upptäcka specifika molekyler genom att märka dem med fluorokromer. Traditionellt observeras celler i en hemocytometer för att underlätta manuell räkning.[källa behövs]
Sedan digitalkameran introducerades under mitten av 90-talet har automatiseringsgraden för bildcytometrar ökat stadigt. Det har lett till kommersiell tillgänglighet för automatiserade bildcytometrar; allt från enkla cellräknare till sofistikerade system med högkapacitetsscreening.
Flödescytometrar
[redigera | redigera wikitext]På grund av de svårigheter som uppstod i början när mikroskopin automatiserades har flödescytometern varit den vanligaste cytometriska apparaten sedan mitten av 50-talet.[2] Flödescytometrar fungerar genom att fokusera enstaka celler med flödestekniker. Cellerna karakteriseras optiskt eller genom att använda en elektrisk impedansmetod som kallas Coulterprincipen. För att upptäcka specifika molekyler under den optiska karakteriseringen färgas cellerna oftast med samma typ av fluorokromer som används av bildcytometrar. Flödescytometrar ger vanligtvis mindre data jämfört med bildcytometrar men har betydligt högre kapacitet.[källa behövs]
Cellsorterare
[redigera | redigera wikitext]Cellsorterare är flödescytometrar som kan sortera celler enligt deras egenskaper. Sorteringen utförs genom att använda en teknik som liknar den som används i bläckstråleskrivare. Vätskeströmmen delas upp i små droppar med hjälp av mekanisk vibration. Dropparna får en elektronisk laddning i enlighet med cellens egenskaper inuti droppen. Beroende på dess laddning avleds dropparna till sist med hjälp av ett elektriskt fält till olika containrar.[källa behövs]
Cytometrar med tidsupplöst mätning
[redigera | redigera wikitext]En viktig egenskap hos cytometrar med tidsupplöst mätning är att de använder ljuskällor som inte genererar värme, till exempel lysdioder. Det gör så att cytometrar med tidsupplöst mätning kan placeras inuti en konventionell cellodlingsinkubator för att underlätta kontinuerlig observation av cellulära processer utan att värme byggs upp inuti inkubatorn.
Historia
[redigera | redigera wikitext]
Hemocytometer
[redigera | redigera wikitext]Cytometrins tidiga historia är nära förknippad med utvecklingen av blodkroppsräkning. Tack vare Karl von Vierordt, Louis-Charles Malassez, Karl Bürker och andra kunde blodkroppskoncentrationen mätas korrekt under slutet av 1800-talet genom att använda blodkroppsräknare, hemocytometern och optiska mikroskop.[3][4]
Fram till 50-talet användes hemocytometern som standardmetod för att räkna blodkroppar.[5] Inom blodkroppsräkning har hemocytometrarna nu blivit ersatta av elektroniska cellräknare. Däremot används fortfarande hemocytometrar för att räkna celler i cellodlingslaboratorier. Processen att manuellt räkna celler med hjälp av mikroskop håller successivt på att ersättas av små automatiserade bildcytometrar.[källa behövs]
Fluorescensmikroskop
[redigera | redigera wikitext]År 1904 konstruerade Moritz von Rohr och August Köhler på Carl Zeiss i Jena det första ultravioletta mikroskopet. Mikroskopets syfte var att uppnå högre optisk upplösning genom att använda ljus med kortare våglängder än synligt ljus. De upplevde dock svårigheter med autofluorescens när de observerade biologiskt material. Lyckligtvis såg Köhler vilken potential fluorescens har. En filterteknik för fluorescensexcitationsljus utvecklades av Heinrich Lehmann på Zeiss år 1910 baserat på Robert Woods arbete. "Lumineszenzmikroskopet" han utvecklade var bara det andra på marknaden efter det som Oskar Heimstädt utvecklade på egen hand. Han arbetade på C Reichert, Optische Werke AG i Vienna som idag är en del av Leica Microsystems.[6][7][8]
Cytofotometri
[redigera | redigera wikitext]I början av 30-talet tillverkade flera firmor ultravioletta fluorescensmikroskop. Det var nu dags för cytometrin att gå ett steg vidare från den tidigare etablerade hemocytometern. Under den tiden utvecklade Torbjörn Caspersson, som jobbade på Karolinska Institutet i Stockholm, en serie av alltmer sofistikerade instrument som kallades cytofotometrar. De här instrumenten kombinerade ett fluorescensmikroskop med en spektrofotometer för att ange mängden nukleinsyror i celler och deras samband med celltillväxt och -funktion. Casperssons tidiga instrument framstår nu som otillräckliga och föråldrade. Dock fick även det här gamla instrumentet resultat och väckte intresset hos andra forskare. En stor del av framstegen inom analytisk cytologi under 40-talet och framåt gjordes av personer som hade emigrerat till Stockholm.[9]
Pulscytofotometri
[redigera | redigera wikitext]
De första försöken att automatisera cellräkning gjordes under andra världskriget. Gucker m.fl. konstruerade en apparat som upptäckte bakterier i aerosoler.[10] Lagercrantz konstruerade en automatisk cellräknare baserad på mikroskopi[11] och identifierade utmaningarna med att justera celler för individuell räkning med hjälp av mikroskopi, något Moldavan hade föreslagit redan 1934.[12] Joseph och Wallace Coulter kringgick dessa svårigheter genom att uppfinna principen att använda elektrisk impedans för att räkna och mäta mikroskopiska partiklar som svävar i vätska.[13][14] Idag är principen känd som Coulterprincipen och användes i den automatiserade blodkroppsräknaren som Coulter Electronics lanserade år 1954. ”Coulterräknaren” var den första kommersiella flödescytometern.[källa behövs]
Under 60-talet förbättrade Dittrich, Göhde och Kamentsky designen som Caspersson inledde 30 år tidigare. Dittrich och Göhdes pulscytofotometer konstruerades kring ett fluorescensmikroskop av Zeiss och kommersialiserades som ICP 11 av Partec GmbH år 1968. Kamentskys apparat kommersialiserades av Bio/Physics Systems Inc. under namnet Cytograph 1970.[15][16] Dessa apparater kunde räkna celler likt den tidigare Coulterräknaren. Än viktigare var att de också kunde mäta cellulära egenskaper. Dessa tidiga cytofotometrar var dock baserade på mikroskopi.[17]
Flödescytometri
[redigera | redigera wikitext]År 1953 utfärdade Crosland-Taylor ett misslyckat försök att räkna röda blodkroppar med hjälp av mikroskopi och löste då problemet med att justera celler genom att använda mantelflöde för att hydrodynamiskt fokusera cellerna.[18] I slutet av 60-talet konstruerade Van Dilla den första cytofotometern som inte var baserad på mikroskopi i Los Alamos nationallaboratorium. Han genomförde detta genom att kombinera Crosland-Taylors genombrott med de fluorescerande färgämnena som ursprungligen utvecklades för mikroskopin och ett laserbaserat fluorescerande detekteringssystem och resultatet blev flödescytometern så som vi känner till den idag.[19][20][21] Fulwyler, som också arbetade på Los Alamos, kombinerade Coulterprincipen med kontinuerlig bläckstråleteknik för att göra den första cellsorteraren år 1965.[22]
År 1973 följde Steinkamp och hans team på Los Alamos upp med en fluorescensbaserad cellsorterare.[23]
På en konferens anordnad av det amerikanska ingenjörsförbundet i Pensacola i Florida år 1978 ändrades namnet pulscytofotometri till flödescytometri, en term som snabbt blev populär.[24] Vid den tidpunkten hade pulscytofotometrin utvecklats till den moderna formen av flödescytometri vars utveckling inleddes av Van Dilla tio år tidigare.[källa behövs]
Referenser
[redigera | redigera wikitext]- ^ ”International Society for Advancement of Cytometry”. http://isac-net.org/ISAC-Cytometry/What-is-Cytometry.aspx. Läst 31 mars 2013.
- ^ Crosland-Taylor, P. J. (1953). ”A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube”. Nature 171 (4340): sid. 37–38. doi:. PMID 13025472. Bibcode: 1953Natur.171...37C.
- ^ Verso, M. L. (1964). ”The Evolution of Blood-Counting Techniques”. Med. Hist. 8 (2): sid. 149–158. doi:. PMID 14139094.
- ^ Verso, M. L. (1971). ”Some nineteenth-century pioneers of haematology”. Med. Hist. 15 (1): sid. 55–67. doi:. PMID 4929622.
- ^ ”The History of Flow Cytometry”. Beckman-Coulter Inc. http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/history-of-flow-cytometry/index.htm. Läst 31 mars 2013.
- ^ Rusk, N. (2009). ”The fluorescence microscope”. Milestones in Light Microscopy. Nature Publishing Group. http://www.nature.com/milestones/milelight/full/milelight04.html.
- ^ Heimstädt O. (1911). Das Fluoreszenzmikroskop.
- ^ Rost, F. W. D. (1995). Fluorescent microscopy, volume II. Cambridge University Press
- ^ Shapiro H. (2004). ”The Evolution of Cytometers”. Cytometry Part A 58A (1): sid. 13–20. doi:. PMID 14994215.
- ^ Gucker, F. T.; O’Konski, C. T.; Pickard, H. B.; Pitts, J. N. (1947). ”A photoelectronic counter for colloidal particles”. J Am Chem Soc 69 (10): sid. 2422–2431. doi:. PMID 20268300.
- ^ Lagercrantz, C. (1948). ”Photo-electric Counting of Individual Microscopic Plant and Animal Cells”. Nature 161 (4079): sid. 25–26. doi:. PMID 18933853. Bibcode: 1948Natur.161...25L.
- ^ Moldavan, A. (1934). ”Photo-Electric Technique for the Counting of Microscopical Cells”. Science 80 (2069): sid. 188–189. doi:. PMID 17817054. Bibcode: 1934Sci....80..188M.
- ^ ”The History of Flow Cytometry”. Beckman-Coulter Inc. http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/history-of-flow-cytometry/index.htm. Läst 31 mars 2013.
- ^ ”The History of Flow Cytometry”. Beckman-Coulter Inc. http://www.beckmancoulter.com/wsrportal/wsr/research-and-discovery/products-and-services/flow-cytometry/history-of-flow-cytometry/index.htm. Läst 31 mars 2013.
- ^ ”Flow Museum”. Partec GmbH. http://www.partec.com/company/flow-museum.html. Läst 24 augusti 2013.
- ^ Mall:Cite patent
- ^ Kamentsky, L. A.; Melamed, M. R.; Derman, H (1965). ”Spectrophotometer: New instrument for ultrarapid cell analysis”. Science 150 (3696): sid. 630–1. doi:. PMID 5837105. Bibcode: 1965Sci...150..630K.
- ^ Crosland-Taylor, P. J. (1953). ”A device for counting small particles suspended in a fluid through a tube”. Nature 171 (4340): sid. 37–38. doi:. PMID 13025472. Bibcode: 1953Natur.171...37C.
- ^ Van Dilla, M. A.; Trujillo, T. T.; Mullaney, P. F.; Coulter, J. R. (1969). ”Cell microfluorometry: A method for rapid fluorescence measurement”. Science 163 (3872): sid. 1213–1214. doi:. PMID 5812751. Bibcode: 1969Sci...163.1213V.
- ^ ”Cytometry Volume 10 – Los Alamos”. Purdue University Cytometry Laboratories. http://www.cyto.purdue.edu/cdroms/cyto10a/researchcenters/losalamos.html. Läst 24 augusti 2013.
- ^ Robinson, J. P. (2009). ”Cytometry – a Definitive History of the Early Days”. i Sack, U.; Tárnok, A.; Rothe, G.. Cellular Diagnostics. Basics, Methods and Clinical Applications of Flow. Karger. sid. 1–28
- ^ Fulwyler, M. J. (1965). ”Electronic separation of biological cells by volume”. Science 150 (698): sid. 910–911. doi:. PMID 5891056. Bibcode: 1965Sci...150..910F.
- ^ Steinkamp, J. A.; Fulwyler, M. J.; Coulter, J. R.; Hiebert, R. D.; Horney, J. L.; Mullancy, P. F. (1973). ”A new multiparameter separator for microscopic particles and biological cells”. Review of Scientific Instruments 44 (9): sid. 1301–1310. doi:. PMID 4279087. Bibcode: 1973RScI...44.1301S.
- ^ ”Partec Flow Museum”. Partec GmbH. http://www.partec.com/company/flow-museum.html. Läst 25 augusti 2013.
Externa länkar
[redigera | redigera wikitext]- Cytometry Volume 10 by Purdue University Cytometry Laboratories